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荧光定量PCR技术的原理及应用
发布者:百代生物  来源:  发布时间:2017-11-22

聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是 1985 年问世的一项基因检测技术。但是,由于传统的 PCR 技术不能准确定量,并且在操作过程中容易受到污染而出现假阳性,使其应用受到很大的限制。为克服上述不足 , 人们采取了许多方法 , 如杂交法 、竞争法 、酶联法及尿苷酶降解法等 , 但均不很成功 , 近年来出现的荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction , FQ-PCR)技术克服上述不足, 实现了 PCR从定性到定量的飞跃 , 它以其特异性强 、灵敏度高 、重复性好 、定量准确 、速度快 、全封闭反应等优点,目前已广泛用于分子生物学和医学等研究领域。


1FQ-PCR 的原理及方法

所谓 FQ-PCR 技术,是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个 PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1.1两个重要术语

(1)荧光域值(threshold):以 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号,一般荧光域值定义为 3~15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。

(2)CT值:也称循环阈值,C代表Cycle,t代表threshold。其含义是:在PCR 循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。(红色建议删除)

1.2作用原理

实时荧光定量 PCR 常用的检测模式有TaqMan探针和SYBR Green I 检测模式。


2应用

1. 病原体测定

FQ-PCR在医学检测中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断, 只要有限的核酸序列清楚 , 运用 FQ - PCR技术 , 就可以检测任何病原体。


目前,对一些培养周期长或缺乏稳定可靠的检测手段的病原体,可以考虑用 FQ-PCR检测,为临床诊断提供依据。FQ-PCR对病原体的检测克服了免疫学检测的“窗口期”问题,可判断疾病是否隐性或亚临床状态。


另外, 抗体检测不能判定是现症感染还是既往感染时,也需要用FQ-PCR方法来确定。临床上常见的病原体感染如:乙型肝炎、结核杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、淋球菌、沙眼衣原体、梅毒螺旋体、幽门螺杆菌、EB 病毒、柯萨奇病毒、弓形虫、甲型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎等, 均可用FQ-PCR方法进行检测。FQ-PCR不仅能准确检测出病原体,还能对治疗和预后监测提供帮助。


2.肿瘤研究

肿瘤发病的分子机制尚未完全清楚 , 但相关基因的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因, 现已得到普遍接受 , 遗传学改变主要引起癌基因的失活。基因突变、缺失、插入、扩增、易位等常见遗传学改变在细胞癌变的过程中都可见到。PCR技术是提示这些遗传学改变最简便和有效的手段。


癌基因表达增加和突变在许多肿瘤早期和良性阶段就出现, FQ-PC技术不但能有效的检测基因的突变, 而且能准确监测癌基因表达量, 可据此进行肿癌早期诊断 、分型和预后判断。例如,CD44基因异常拼接表达几乎100%出现于某些泌尿系肿瘤, 而对照组完全没有这种异常表达。


3.基因表达研究

PCR技术首次在遗传病方面的临床应用就是从检测镰状细胞和α-地中海贫血的基因突变开始的。


几十年来 , 该技术在遗传病诊断的临床应用方面有了重大进展。从使用范围来看, 它能用于检测已知基因序列的任何遗传病基因的突变和缺失及表达量的异常,从灵敏度方面看, 它能从单细胞进行特异基因扩增, 实现植入前基因诊断。


PCR技术还可用于端粒酶的检测。多色荧光标记探针的PCR技术可检测出等位基因是纯合子还是杂合子基因突变或缺失。例如胰岛素基因、ApoE基因的检测等。


4.免疫组份分析

对免疫T细胞群体V - β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段, 可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行。1997年Lang等用FQ-PCR技术进行实验,从而避免了这些问题, 他们在反应系统中引入荧光探针, 将下游引物与探针固定, 然后, 针对不同的V - β成份, 选用特异的上游引物进行扩增 ,再对反应中产生的荧光信号进行处理, 即可获得各个成份的数据。


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