“Bioline,siRNA转染试剂,假病毒包装,荧光定量PCR试剂,唾液DNA提取试剂”/

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荧光定量PCR常见问题解析
发布者:百代生物  来源:  发布时间:2017-11-24

1.什么是荧光定量PCR?

实时荧光定量PCR (QuantitativeReal-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。·

Real-time PCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

2.普通PCR与荧光定量PCR技术区别?

① 荧光定量PCR能够实时监测PCR反应的全过程,对每一个循环迚行定量戒定性分析;而普通PCR只能对反应的终产物进行半定量或定性分析。

② 荧光定量PCR的结果分析可以直接通过电脑读出,而普通PCR的结果必须通过下一步的电泳进行条带分析。


3.荧光定量PCR技术的特点 :

① 灵敏度高、特异性强。 

② PCR实验过程全封闭,仪器自动分析和获取实验结果,无后续实验操作。

③ 实时监测反应过程,定量更准确。 

④ 定量范围宽,可达到10个数量级。 

⑤ 可以实现一次反应检测多个样本。 


4、实时荧光定量PCR实验操作注意事项 :

① 应该带一次性乳胶手套并经常更换,在试剂准备室和样本处理室应该配备负压式生物安全柜,以防止对环境或对样品的污染。 

② 要严格防止气溶胶交叉污染。采取的措施有:使用一次性带滤芯移液枪吸头;不使用吸头吹打液体进行混匀;在生物安全柜中进行离心操作;尽量减少在生物安全柜以外开启试剂或PCR管;禁止在荧光定量PCR结束后打开PCR管盖。 

③ 实验中牵涉的有毒有害及有污染的样本及试剂应该严格按照生物安全相关规定操作和处理。 

④ 荧光探针应该避光保存,加入反应液后应尽快上机,以防探针粹灭。

⑤ 在进行RNA相关操作时,必须使用无RNase的实验器具及耗材,并加样后立即上机操作,以防RNA的降解。 

⑥ 所有试剂在开启之前都要瞬时离心;试剂配制完成后要瞬时离心以去除气泡。 ⑦ 不要在荧光定量PCR管上做任何标记,不能用手接触PCR管盖上采光部位。


5、实时荧光定量PCR实验无CT值出现或无扩增信号的问题及解决方案: 

① 实验的循环数不够,设计的循环数应该在35以上,可增加至45个循环,但不可高于45个循环。 

② 通道选择不对,应该仔细阅读产品说明书,根据说明书的要求选择采光通道。 

③ 荧光采集位置设计有误,应该仔细阅读产品说明书,根据说明书的要求设置荧光信号采集位置。 

④ 引物或探针降解,要求厂家重新发货验证。 

⑤ 模板量不足,增大模板的加入量。 

⑥ 模板降解,尤其模板是RNA时很容易由于模板的降解而产生假阴性结果;通过缩短样本提取和加样时间,加入RNA酶抑制剂等方法进行改进。 

⑦ 加入样品中存在PCR抑制物。 ⑧ PCR仪器故障,找仪器工程师排除。 

⑨ 样本中不存在对应模板或样本选择错误。 


6、实验中出现假阳性及其解决方案: 

① 实验室气溶胶污染,严格按照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》进行实验室建设,在实验操作过程中严防汽溶胶的产生。 

② 标本交叉污染,通过规范实验操作防止。 

③ 移液器使用引起的交叉污染,通过使用带滤芯吸头和规范移液器使用方法来防止。 

④ 引物探针设计的特异性不够引起,要求厂家重新研发产品。 ⑤ 反应体系中Mg2+浓度过高,要求厂家重新研发产品。 


6、实验结果重复性差及其解决方案 ① 实验操作过程中加样不准确。 

② 有液体吸附在管壁上,通过瞬时离心解决。 

③ 荧光定量PCR仪孔间温度不一致或孔间升降温不一致。 ④ 荧光定量PCR管孔间均一性太差。 

⑤ 模板浓度过低,模板浓度越低,实验重复性越差。 


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