“Bioline,siRNA转染试剂,假病毒包装,荧光定量PCR试剂,唾液DNA提取试剂”/

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荧光PCR/实时定量PCR技术应用简介
发布者:百代生物  来源:  发布时间:2017-11-27

一.荧光PCR原理 

1.荧光共振能量传递 (FRET)

某荧光标记基团在激发光刺激下生成某波长的发射光,当另一屏蔽基团与其距离合适时,原发射光将会被屏蔽基团所吸收,并转化为其他波长的发射光或热能,称之为FRET。

          

2.荧光化学:

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

二.实时荧光PCR技术靶基因的确定及引物和探针的设计原则

1.靶基因的确定:选择检测组共有的基因以避免检测的假阴性(漏检)。

2.检测片段的确定:选择检测组内的保守 (突变少)(避免假阴性)、组间特异的序列 (突变多)(避免假阳性)作为引物探针的设计位置。片段长度70-150bp。

3.引物:长度17-25bp;GC含量30-80%;退火温度(Tm值)58-60℃;避免稳定的引物二聚体(特别是多联检测)及发夹结构(自由能大于-3.5kc/m);序列不能出现连续的G,3’端避免G或C,最后5个碱基内避免两个以上的G或C。

4.探针:长度20-30bp(Taqman)或16-25bp(MGB);GC含量30-80%;Tm值为68-70℃;避免稳定的二聚体及发夹结构 (自由能大于-3.5kc/m);5’端不能是G;位置尽量靠近上游引物;选择波长差异较大(多联检测)或Fam(单联检测)的荧光标记。

三.特点和优势

1.特异性强:引物和探针的“双保险”,避免检测的假阳性。

2.灵敏度高:分析PCR产物的对数期,自动化仪器收集荧光信号,避免了许多人为因素干扰。

3.避免污染:全封闭反应,无须PCR后处理。

4.实现定量:运用标准品获得标准曲线,结合Ct值进行准确定量。

5.高效低耗:可实现一管多检。

6.操作简便:在线式实时监测扩增结果,不必接触有害物质。

7.快速:反应时间<1.5小时。

四.实用意义:

1.提高检测效率,缩短检测周期,提高通关速度;

2.降低检测成本,提高经济与社会效益。


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