“Bioline,siRNA转染试剂,假病毒包装,荧光定量PCR试剂,唾液DNA提取试剂”/

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谈谈实时荧光定量PCR之绝对定量分析
发布者:百代生物  来源:  发布时间:2017-11-28

在科研工作中,我们常常想通过PCR的方法确定未知样本中目标基因的绝对含量,如检测乙肝病人的每毫升血液中HBV DNA的精确拷贝数,这时我们就用到了实时荧光定量中的绝对定律分析。

            


绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。将标准品稀释至不同浓度,作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标,以测得的CT值为纵坐标,绘制标准曲线,对未知样品进行定量时,根据未知样品的CT值,即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。


1.绝对定量标准品的制备方法


将待测序列装入已知大小的质粒中作为标准品。ND-1000型微量紫外分光光度仪测质粒浓度,按以下公式计算质粒拷贝数:

质粒拷贝数( copies •μ L -1)=6.02 ×1023 ( copies • mol-1)×质粒浓度( g •μL-1) /质粒分子量( g • mol -1)

将质粒用ddH2O进行10倍倍比稀释,待测品与标准品加在同一块96孔板,使用与标准质粒相同的反应条件和相同的引物序列进行荧光定量PCR。以标准品拷贝数的对数值为横坐标,以CT值为纵坐标建立标准曲线。(X:Ct 值,Y:起始模板对数值)(见Fig.1)


2.倍比梯度稀释方法:


1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液,得标准品ii

1v标准品ii+9v稀释缓冲液,得标准品iii

1v标准品iii+9v稀释缓冲液,得标准品iv

1v标准品iv+9v稀释缓冲液,得标准品v

依次倍比稀释


3.目的基因绝对值的计算


根据待测样本的CT值,即可在标准曲线中计算出荧光信号达到阈值时扩增产物的量,然后根据公式LogYCt=LogX+Ct×Log(1+E)计算原始模板的拷贝数。

X:原始模板的拷贝数;E:扩增效率;YCt:荧光信号达到阈值时扩增产物的量


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