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手把手教你做细胞转染
发布者:百代生物  来源:  发布时间:2017-12-5

经典的转染技术最初用于将质粒DNA导入细胞中,而质粒DNA仍是目前最常用的转染载体。含有重组基因和调控元件的DNA质粒可以转染至细胞内,用于研究基因功能和调控、基因产物突变分析和生物化学特性、基因表达对细胞健康和周期的作用以及蛋白质的大规模生产 (用于纯化和下游应用)。载体的拓扑结构(线性或超螺旋)和大小、质粒DNA的质量及启动子选择是影响质粒DNA转染效率的主要因素。


             


1.载体考虑因素

做转染时到底选择环状DNA还是线性DNA呢?且看下文:

采用高度超螺旋DNA进行瞬时转染的效率高于线性DNA,这可能是由于环状DNA对外切酶的敏感性不高,而线性DNA片段则可以在这些酶的作用下快速降解此外,原子力显微镜分析显示,阳离子脂质体试剂与环状和线性DNA可以形成极为不同的复合结构:环状DNA可以观察到紧密的球形或柱形结构,而线性质粒则呈珠链样结构。

尽管阳离子脂质体介导的环状质粒转染可能是通过内吞作用进入细胞,但线性DNA结构的进入通路与之差异明显且效率较低。

线性DNA可以最佳整合至宿主基因组,因此使用线性DNA进行稳定转染的效率更高。尽管具有自由端的线性DNA被细胞摄取的效率较低,但更容易发生重组,整合至宿主染色体生成稳定转化体的可能性更高。在阳离子脂质体介导的转染中,尽管细胞摄取效率相当,但较大质粒的核输送效率低于较小的质粒分子。使用质量或摩尔浓度相等的不同大小的载体可以观察到上述现象,说明质粒的核输送可能会受到细胞内运输速率的限制,较小的质粒可以快速通过细胞质,躲避降解作用和细胞防御机制。

 

2.质粒DNA的质量

质粒DNA的纯度和质量是转染成功的关键。

使用最高纯度的质粒DNA (不含苯、氯化钠和内毒素)可以获得最佳的结果。污染物会杀死细胞,而盐会干扰脂质体复合物的形成,从而降低转染效率。

内毒素,也被称做脂多糖(LPS),是格兰氏阴性菌(比如大肠杆菌)细胞膜的成分。它通常在质粒制备的裂解步骤中释放出来,并且与质粒DNA共纯 化。与质粒DNA共存的内毒素会导致转染效率显著下降,特别是对于原代细胞和敏感性的细胞系而言。如果要转染内毒素敏感的细胞(比如原代细胞、悬浮细胞和 造血细胞),或者想要获得最高的转染效率和最低的细胞毒性,我们推荐使用一些商业化的试剂盒来纯化DNA——这些试剂盒是经过专门的设计,能去除内毒素, 保证得到最佳的转染结果。

DNA-脂质体复合物或DNA溶液过度涡旋振荡会导致剪切作用,尤其是较大的分子,从而降低了转染效率。稀释DNA中的EDTA浓度不得超过0 3 mM。


3.基因产物和启动子质粒

启动子的选择取决于宿主细胞系、需要表达的蛋白质和期望的表达水平。许多研究人员使用强启动子CMV (巨细胞病毒),它可以在各种细胞类型中提供最高的表达活性。另一个用于哺乳动物细胞的高水平蛋白质表达的强启动子是EF-1α (人类延伸因子-1α)。但是,使用过强的启动子促进具有潜在毒性的基因的表达,会在质粒DNA的瞬时转染中引起一定的问题。

建议使用弱启动子转染具有潜在毒性的基因产物。毒性基因产物也是稳定转染细胞筛选的问题之一。当抗生素抗性基因表达危害转染细胞的健康时,表达该基因的细胞会丧失生长优势,从而无法获得稳定转染的克隆(组成型启动子)。此时,可以使用诱导型启动子控制基因表达的时序,从而实现稳定转染子的筛选。诱导型启动子一般需要诱导物分子(如金属离子、代谢产物或激素)存在方可发挥功能,但一些诱导型启动子可以以相反的方式发挥功能,即在无特定分子存在的情况下诱导基因表达。

细胞类型特异性的启动子也很常用,如用于昆虫细胞表达的多角体蛋白启动子。文献搜索是确定哪种启动子最适合您的细胞系或应用的最佳工具。











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