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百代生物教您轻松翻越细胞转染的八大坑
发布者:百代生物  来源:  发布时间:2017-12-11

细胞转染是实验中常见的实验手段,从基因表达到RNA干扰,再到如今大热的基因组编辑,他们都离不开细胞转染这个前提。问题是,细胞并不想接收它们,而细胞膜也是一个可怕的屏障,因此科研工作者们往往面临转染效果不好或者细胞死亡等严重问题,尤其是针对原代细胞的转染难度更大。本文总结了细胞转染效率低下的八大坑,并教您如何轻松翻越这些坑,招招干货!

                  



1.准备不足

做转染的时候,在开展正式实验前要多做预试验,优化转染条件。优化转染条件包括:转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、孵育时间等等。


2.细胞状态不好

细胞状态不好,会导致转染效率低下。一般进行转染的细胞应该处于对数生长期。如果是贴壁细胞的话,贴壁率应该在70-80%;如果是悬浮细胞的话,应该是6X105个/孔(24孔板),一般是转染前一天换液,转染前用无血清培养基或PBS洗细胞一次。转染的整个过程都不应该有抗生素。


3.试剂过期

过期转染试剂会大大降低转染效率,千万不要为了省钱,影响实验进度。


4.未加血清

传统脂质体转染后未及时加入血清,会导致细胞大量死亡。一般要在转染后的4-6小时换液且换为有血清的培养基。


5.细胞污染

细胞污染也是造成细胞死亡,转染效率低下的一大原因。首先,转染细胞用的质粒必须保证无菌。而现在市场上的一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。这里再贡献一个独门绝招:将提完质粒后或者提的最后一步,用75%乙醇沉淀,这样就除菌了。


6.质粒不达标

转染用的质粒首先要保证数量,一般为2 μg以上。质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他对细胞有毒害作用的物质(内毒素),也会影响转染效率。

(推荐使用QIAGEN的无内毒素质粒提取试剂盒:Qiagen EndoFree Plasmid Kit可以纯化得到至多10mg无内毒素高转染级纯质粒,纯化得到的DNA内毒素水平低于0.1EU/ug)。


7.不注意细节

在转染之前更换一次37℃预温的培养基,可提高转染效率。转染试剂和DNA/RNA混合物应当一滴一滴地滴下来,从培养皿一边滴到另一边,边滴边轻摇培养皿,以确保均匀分布和避免局部高浓度。这些都是一些细枝末节,但是,如果不注意的话,也会造成转染效率低下。



8.转染试剂选择不匹配

转染试剂跟细胞系也是讲究配合默契的,使用同一种试剂,不同细胞系转染效率通常不同。如果选择了一款毒性比较大的转染试剂,而自己养的细胞有特别容易死亡的话,那就要换转染试剂了。选一款适合自己试验的转染试剂是试验成功的关键因素之一。


细胞转染是个细活,希望广大业内人士学习了以上经验之后能够轻松翻越转染过程中的这些坑,早日出成果!





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